文章来源说明

物品准备

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度移液器及吸头：0.5-10μL、5-50μL、20-200μL、200-1000μL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

5. ELISA试剂盒

注意事项

1. 所有试剂都必须在使用前达到室温 20-25℃。使用后立即冷藏试剂

2. 在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。整个过程中不要让微孔干燥时间过长。

3. 清洁板底残留的液体和手指印，否则影响 OD 值。

4. 底物显色液应呈无色的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5. 在储存和温育时避免强光直接照射。

6. 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中试剂的生物活性。

7. 不同货号和批号组分不得混用。

8. 注意物种

样本准备

注意事项

1. 试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度。

准备方法

1. 血清：将收集于血清分离管的全血样本在室温放置2小时或2-8℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2. 血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集样本，并将样本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3. 组织匀浆：用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响检测结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨或匀浆机研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4. 细胞培养物上清：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

5. 细胞裂解液：贴壁细胞用预冷PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化， 1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用预冷PBS清洗3次，每1×10^6个细胞中加入150-200μL PBS重悬（推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可适当减少PBS体积）并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。

6. 其它生物样本：1000×g离心20分钟，取上清即可检测。

7. 样本外观：样本应清澈透明，悬浮物应离心去除。

8. 样本保存：样本收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，样本溶血会影响最后检测结果，因此溶血样本不宜进行此项检测。

样本稀释

1. 稀释 100 倍：一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内，做 100 倍稀释；

2. 稀释 1000 倍：两步稀释。取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内，做 20 倍稀释，再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内，做 50 倍稀释，总共稀释1000 倍；

3. 稀释 100000 倍：三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内，做 40 倍稀释，再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内，做 50 倍稀释，最后取 5μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内，做 50 倍稀释，总共稀释 100000倍；

检测前准备工作

1. 请提前 10 分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温

2. 标准品梯度工作液配制：加入 1mL 通用稀释液至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀并进行稀释。

3. （DA、EPI、5-HT）Biotin-抗体工作液配制：使用前15分钟将100×浓缩Biotin-抗体于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩Biotin-抗体稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，现配现用。

4. （DA、EPI、5-HT）酶结合物工作液配制：使用前15分钟将100×浓缩酶结合物于1000×g离心1分钟，以通用稀释液将100×浓缩酶结合物稀释成1×工作浓度(例：10μL浓缩液+990μL通用稀释液)，现配现用。

5. （NE、GC）HRP-抗原工作液配制： 使用前15分钟将浓缩HRP-抗原于1000×g离心1 分钟，以通用稀释液将100×浓缩HRP-抗原稀释成1×工作浓度(例：10 μL浓缩液+990μL通用稀释液)，现配现用。

6. 1×洗涤液配制：取 10mL 20×洗涤液到 190mL 蒸馏水中（从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可放置室温，待结晶完全溶解后再配制)。

操作步骤

1. 从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 加样：分别将样本或不同浓度标准品按照50μL每孔加入相应孔中，空白孔加入50μL通用稀释液。

3. （DA、EPI、5-HT）：每孔加入50μL Biotin-抗体工作液，盖上封板膜后37℃温育60分钟。

4. （NE、GC）紧接着每孔加入50μL HRP-抗原工作液，盖上封板膜后37℃温育60分钟。

5. 洗板：弃去液体，每孔加入300μL 1x洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3次。

6. （DA、EPI、5-HT）：加酶结合物工作液：每孔加入100μL酶结合物工作液，盖上封板膜后37℃温育30分钟。

7. 洗板：弃去液体按步骤5洗涤方法，洗板5次。

8. 加底物：每孔加入90μL底物(TMB)，盖上封板膜，37℃避光温育15分钟。

9. 加终止液：取出酶标板，每孔直接加入50μL终止液，立即在450nm波长处测定各孔的OD值。

标准物浓度

1. EPI：2000pg/mL、1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、 31.2pg/mL、0pg/mL

2. NE：5000pg/mL、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312.5pg/mL、156.25pg/mL、78.12pg/mL、0pg/mL

3. 5-HT：200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、 3.12ng/mL、0ng/mL

4. DA：1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.2pg/mL、 15.6pg/mL、0pg/mL

5. GC：20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.312ng/ml、0ng/ml

小鼠参考浓度

1. EPI：150pg/ml（参考文献：35672760）

2. NE: 180pg/ml（参考文献：35672760;32811805）；4500pg/ml(参考文献：37415171)

3. 5-HT:1000ng/L（参考文献：36737776）

4. DA：75pg/ml(参考文献： 37415171)

5. GC:肾上腺酮 250pg/ml（参考文献：35672760）1000nmol/L(参考文献：32811805)

参考文章

1. 小鼠肾上腺素(EPI)ELISA检测试剂盒

2. 小鼠去甲肾上腺素(NE)ELISA试剂盒

3. 小鼠5羟色胺(5-HT)ELISA检测试剂盒

4. 小鼠多巴胺(DA)ELISA检测试剂盒

5. 小鼠糖皮质激素(GC)ELISA检测试剂盒

试剂盒信息