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本组实验基于碧云天BeyoTSATM三标四色多重荧光染色试剂盒(488/555/647/DAPI)进行。
背景介绍
本protocol适用于使用碧云天BeyoTSATM三标四色多重荧光染色试剂盒(产品编号P1351S或P1351M)对石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片或涂片等样品进行多重荧光染色。该方法基于酪酰胺信号放大(TSA)技术，可同时检测1-3种目的蛋白，具有高灵敏度、低背景和突破抗体种属限制的优点。实验流程包括样品处理、抗体孵育、TSA标记、抗体洗脱和多重循环染色等步骤。以下protocol以石蜡切片为例，其他样品类型可参考调整。
原理简介
TSA技术原理：通过辣根过氧化物酶(HRP)催化酪酰胺底物(如Tyramide-488、Tyramide-555)生成活性自由基，与靶蛋白附近的酪氨酸残基共价结合，实现信号放大。每轮标记包括一抗孵育、二抗-HRP孵育、TSA标记和抗体洗脱，循环进行3轮以标记不同靶蛋白，最后用DAPI染核。这种方法可避免抗体交叉干扰，适用于低丰度靶标。
适用样品：石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片、细胞涂片或多孔板培养细胞。
物品准备
试剂盒内容（以P1351S小包装为例）
- BeyoTSATM Tyramide-488(200X): 25μl
- BeyoTSATM Tyramide-555(200X): 25μl
- BeyoTSATM Tyramide-647(200X): 25μl
- TSA Reaction Buffer: 25ml
- 增强型免疫染色抗体洗脱液: 30ml
- DAPI染色液: 5ml
- 组织自发荧光淬灭剂: 2ml（首次使用前加3ml无水乙醇）
- 抗荧光淬灭封片液: 2ml
- 说明书: 1份
（注：中包装P1351M用量按比例放大。）
自备试剂
- 洗涤液：PBS(C0221A)
- 固定和通透试剂：4%多聚甲醛固定液
- 抗原修复液：柠檬酸钠抗原修复液
- 内源性过氧化物酶封闭试剂：3%过氧化氢溶液。
- 封闭液：5%BSA。
- 一抗和二抗：对应的无荧光的一抗二抗
- 其他：免疫组化笔(P0139)、载玻片染色盒(FSR958)、翘板摇床(E6673)（推荐用于所有洗涤步骤）。
实验步骤
第一天
- 提前70摄氏度烘片子过夜。
- 环保脱蜡剂1 浸泡15min
- 环保脱蜡剂2 浸泡15min
- 100%无水乙醇 浸泡10min
- 100%无水乙醇 浸泡10min
- 95%乙醇 浸泡5min
- 85%乙醇 浸泡5min
- 70%乙醇 浸泡5min
- ddH2O 浸泡5min
- PBS1 浸泡7min
- PBS2 浸泡8min
- 抗原修复：中大火预热柠檬酸钠溶液3分钟，放入组织切片。中大火加热柠檬酸钠5min*3,中间间隔加入柠檬酸钠溶液防止干片。后室温放置复温（可于冰上复温，但小心脱片）。
- 内源性过氧化氢酶封闭：用免疫组化笔圈出组织区域，滴加3%过氧化氢溶液，室温孵育10-15分钟。PBS洗涤5min*3。
- 背景封闭：5%BSA 37摄氏度封闭 1小时到1个半小时。（不洗涤！！甩掉多余液体）
- 一抗（1%BSA稀释，稀释比对照说明书）孵育，4度冰箱过夜，或37摄氏度2小时
第二天
- 提前37摄氏度烘箱复温1小时，PBS 洗5min*3遍。
- 二抗（1%BSA稀释，稀释比对照说明书）37摄氏度孵育1.5小时，PBS洗5min*3遍。
- TSA染色工作液配制与标记：配制工作液（以1个样品50μl为例）—BeyoTSATM Tyramide-substrate(200X): 0.25μl+TSA Reaction Buffer: 50μl
- 滴加TSA工作液覆盖样品，避光室温孵育10分钟，洗涤3次×5分钟。
- 增强型免疫染色抗体洗脱液洗脱——滴加洗脱液覆盖样品，室温孵育10分钟，洗涤3次×5分钟。
- 重复封闭、一抗、二抗步骤，换用第二种和第三种一抗、对应二抗及相应的Tyramide-substrate。每轮结束后彻底洗脱抗体，避免交叉反应。
- DAPI染色细胞核：滴加DAPI染色液覆盖样品，避光室温孵育10分钟，洗涤3次×5分钟。
- 自发荧光淬灭（不做）
- 封片与镜检：吸除液体，用抗荧光淬灭封片液封片。
• 使用荧光显微镜或共聚焦系统在相应通道（如488nm、555nm、647nm、DAPI通道）观察并采集图像。参考附录中的荧光光谱信息（如Tyramide-488 Ex/Em: ~488/515nm）。
注意事项
- 一抗和二抗浓度需预实验优化，TSA工作液浓度可在0.2-2X范围内调整。
- 多重染色前，务必先进行单标测试，确保每种抗体效果理想。
- 所有步骤避光，防止荧光淬灭；试剂-20℃保存，避免反复冻融。
- 使用翘板摇床改善洗涤效果；组织自发荧光淬灭剂有毒，需戴手套操作。
- 背景高：增加洗涤次数或优化封闭条件。
- 信号弱：检查抗体效价或延长TSA孵育时间（但不超过10分钟）。
结果分析
成功染色后，应可见清晰的多色荧光信号：Tyramide-488（绿色）、Tyramide-555（橙红色）、Tyramide-647（远红色）及DAPI（蓝色核染色）。
图像分析可使用多光谱成像系统，避免通道串扰。
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