文章来源说明

实验前准备

样本制备：

1. 重悬液配方：推荐使用1x DPBS、HBSS或PBS为基础，并添加以下成分：
1. 0.5-2% BSA 或 2% FBS（减少细胞粘连和背景）
2. 25mM 中性HEPES（维持pH稳定）
3. 1-5mM EDTA 或 10U/ml Dnase I（防止细胞结团）

2. 样本浓度：将细胞浓度调整在 1×10⁵ 至 1×10⁷ cells/mL 之间。过高的浓度会影响液滴形成，降低分选效率

3. 样本过滤：上机前必须使用70μm细胞滤网过滤，以去除细胞团块和杂质。请准备备用滤网。

对照与接收管设置

1. 必需对照：准备空白对照（未染色细胞）、单阳对照（用于调节多色荧光补偿）和阴性对照。

2. 接收管：使用无菌的5mL流式管或离心管，预先加入约1/3体积的接收液（如完全培养基、PBS或含50%-100% FBS的PBS）。

3. 细胞保护：整个操作过程尽量在冰上进行，并使用预冷的缓冲液，以最大限度保持细胞活性。

物品清单

1. 制备好的单细胞悬液及各对照管

2. 样本缓冲液、无菌流式管、移液枪及无菌枪头

3. 70μm细胞滤网

4. 装有接收液的接收管、冰盒

5. 无尘纸、75%乙醇、擦镜纸

操作步骤

开机、初始化与系统启动

1. 软件开机：打开电脑，启动CytExpert SRT软件。在软件界面选择 “细胞仪”->“开机” ，仪器将进行自检

2. 执行初始化：
1. 点击“初始化”。若初始化报错，可尝试选择“细胞仪”->“关机”，等待片刻后重新“开机”并再次初始化。
2. 初始化过程中，超声清洗喷嘴（超声仪内为75%乙醇）。
3. 初始化完成后，检查软件界面右下角显示的鞘液、废液桶和关机液的液位是否充足。

3. 系统启动：
1. 点击左上角“系统启动流程”，用擦镜纸轻轻擦干喷嘴。
2. 系统启动过程约需10分钟。启动完成后，仪器进入待机状态。

分选设置与执行

1. 质控与校准：
1. 系统会提示是否进行质控，选择“是”。
2. 质控完成后，软件会自动弹出“立即开始分选校准”对话框，选择“是”以完成校准。

2. 创建分选方案：
1. 点击左下角第五个图标（“流式分选”），最多可设置4路分选
2. 设门：在散点图上绘制逻辑门，圈定目标细胞群。
3. 选择分选模式
1. 富集模式：用于快速富集目标细胞，纯度要求可稍放宽。
2. 纯度模式：对分选纯度要求极高时（如>98%）使用。
3. .单细胞模式：用于向96或384孔板中分选单个细胞（单克隆筛选）
4. 混合分选模式:此模式可捕捉因纯度模式设定而被丢弃的珍贵目标细胞，特别适用于比例极低的稀有细胞分选，能有效提高得率 。
5. 设置目标：设定需要分选的目标细胞数量或事件数。
6. 设置接收管：选择接收管类型（如5mL管）并输入接收液的初始体积。

上样分选

1. 将过滤后的样本管放置于样品架，点击“运行”。

2. 样本流速：建议设置为20，最高不超过30。流速过高可能导致细胞变形，降低分选效率

3. 点击“分选”开始实验，分选将自动记录数据。

4. 分选过程监控：密切观察液流稳定性及事件率，确保分选正常进行。

分选结束

1. 达到目标数量后，分选自动停止。点击“卸载样本”。

2. 对于关键实验，可取部分分选后的细胞进行回测，以验证分选纯度和细胞活性。

关机与日常维护

1. 执行每日清洗
1. 分选全部完成后，在菜单栏选择“细胞仪”->“每日清洗”。
2. 程序将自动用清洗液清洗10分钟，再用去离子水清洗10分钟。

2. 系统关机
1. 清洗完成后，选择“细胞仪”->“系统关机”，此过程大约需要4分钟。

3. 喷嘴维护
1. 关机后，取下喷嘴并进行超声清洗（超声仪内为75%乙醇），然后妥善存放。

4. 清洁工作区
1. 用75%酒精的无棉絮布仔细擦拭电压管和喷嘴底座。
2. 用无棉絮棉片擦拭分装口底部。

5. 软件关闭
1. 最后，在软件中选择“细胞仪”->“关机”，然后退出软件并关闭计算机。
2. 请注意：不要关闭仪器主机本身的电源。

重要注意事项

1. 仪器预约与样本审核：需提前预约（如提前一周），并遵守取消政策（如提前2天取消）。样本不合格（如未过滤、细胞团块多）时，负责人有权取消上机资格。

2. 细胞活性保护：除了冰上操作外，可使用7-AAD、PI等染料排除死细胞。含多聚甲醛的固定细胞样本无法进行活性分选。

3. 平衡分选三要素：分选的速度、纯度和得率三者难以兼得，需根据实验目的确定优先级 。例如，高纯度分选可能需要牺牲一定速度。