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流式细胞仪标准操作规程

实验前准备

1. 样本制备：细胞悬液需用PBS或无血清培养基重悬。上机前，必须使用70μm细胞滤网过滤，以去除团块和杂质，防止堵塞仪器液路

2. 细胞计数：上机前应对细胞进行计数，推荐浓度为1×10⁶ cells/ml左右，以确保采集时细胞流速稳定。

3. 对照设置：实验必须设置空白对照（未染色细胞）、单阳对照（用于调节多色荧光补偿）和阴性对照。

开机与初始化

1. 检查液路：确认鞘液桶液位充足（建议在3/4至4/5满之间）；确认废液桶有足够空间，若废液已满，需先清理并按规范加入消毒液（如400ml 10%漂白水）。

2. 开启仪器：严格按照顺序开启电源：稳压器 → 流式细胞仪主机 → 计算机

3. 初始化：
1. 当日第一位使用者：在软件中执行“初始化”或“Prime”功能，以排除管路中的气泡。通常需要加入去离子水，等待约10分钟。
2. 非首位使用者：在软件中选择“细胞仪-开机”，通常无需再次初始化

软件操作与参数设定

1. 打开软件，创建新实验或从模板新建。设置数据存储路径（如D盘指定文件夹），并为实验文件合理命名

2. 设定图形：
1. 单参数分析使用直方图
2. 双参数及以上分析使用散点图

3. 设置采集参数：
1. 关闭未使用的通道：在通道设置中，关闭本次实验不用的荧光通道，以减少干扰
2. 调整阈值：通常在FSC（前向散射）上设置阈值，以去除碎片和噪声的干扰
3. 调整增益/电压：这是关键步骤。使用空白管或阴性对照样本，通过调节FSC和SSC的增益，使目标细胞群在散点图上清晰显示。然后调节荧光通道的电压，使阴性细胞群落在10^0-10^1区间内
4. 设置停止条件：可设定为记录特定时间（如600秒）或采集特定细胞数量（如10,000个）。若目标细胞比例较低，建议延长采集时间或取消时间限制，改为采集足够多的事件数

4. 调节荧光补偿：进行多色荧光实验时，必须使用单阳样本调节荧光补偿，以消除荧光光谱重叠带来的干扰

样本检测与数据采集

1. 选择流速：初始调节参数时使用低速；参数调好后，可根据实验需求提高至中速或高速

2. 上样采集：
1. 点击“运行”，开始获取数据。在正式记录前，可先在不存储的模式下观察细胞分布，微调电压和补偿。
2. 确认参数设置满意后，开始正式记录数据。注意观察样本量，严禁吸空。

3. 设门策略：
1. 建议使用多边形门而非严格的矩形门，可以更精确地圈定细胞群体
2. 常见的逻辑顺序为：在FSC-A/SSC-A图中圈定所有细胞 → 在FSC-A/FSC-H图中圈定单细胞群 → 分析目标荧光信号

实验结束与关机清洗